钙离子荧光探针(Rhod-4 AM)

产品货号：

KM0041

中文名称：

钙离子荧光探针(Rhod-4 AM) ,超级纯

英文名称：

Rhod-4, Acetoxymethyl Ester

产品规格：

50μg|5×50μg

发货周期：

1～3天

产品价格：

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Rhod-4,AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-4，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2～5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

Rhod-2虽然是最受欢迎的红色荧光Ca²⁺荧光探针，但Rhod-2的线粒体定位和细胞中高基底Ca²⁺信号使其在某些细胞应用中严重受限制。另外，Rhod-2在488nm处很不理想的激发波长使其在某些只有488nm激发光源的仪器比如FLIPRTM上信号很弱。Rhod-4正是根据这些缺陷而改进的，具有以下特征：

Rhod-4的最大激发和发射波长是530nm和555nm。虽Rhod-4最大激发波长是530nm，但在488nm处
激发下的信号也相当强（见下图）。除了能在514nm，532nm和546nm的长波长激发之外，Rhod-4用氩离子激发器在488nm激发下也能得到理想的荧光信号。Rhod-4随着增加的Ca²⁺浓度荧光信号而增强（555nm发射波长），一旦与Ca²⁺结合荧光约增强＞200倍。由于许多细胞受刺激后的Ca²⁺浓度提高通常是5～10倍，因此，Rhod-4是一款优秀的检测此范围内Ca²⁺浓度变化的高灵敏探针。
一旦受激动剂刺激后，Rhod-4在细胞内的荧光明显强于Rhod-2（信噪比）。更重要的是，Rhod-4主要定位在细胞胞浆内，不像Rhod-2主要定位在线粒体。另外，Rhod-4具更低的温度依赖性的细胞加载特性，不管室温还是37℃产生相似的结果。这一特征使Rhod-4比Rhod-2在HTS应用中更有优势。

分子量：1015.96
外观：红色固体
光谱特性：Ex/Em=530/555nm
Kd（Ca²⁺结合）：525nm
溶解性：溶于DMSO（2～5mM）

产品组成

组分	50μg	5×50μg
钙离子荧光探针(Rhod-4 AM)	50μg	5×50μg
说明书	1份	1份

保存：-20℃，干燥避光，有效期1年。

注意事项

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
Rhod-4,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20～25℃温育片刻至全部融解后使用。
Rhod-4,AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

一、试剂准备

配制Pluronic F-127母液：称取100mgPluronic F-127粉末（货号：KM0188～1G）中加入500μlDMSO，配制成20%(w/v)DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3)或者其他生理缓冲液

二、操作步骤

用无水DMSO溶解Rhod-4,AM配制成2～5mM的储存液，或将已配好的Rhod-4,AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50μgRhod-4,AM中加入12.3μL无水DMSO）。准备Rhod-4,AM工作液之前，有时需要往Rhod-4,AM储存液中加入适量的20%Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。
注①：Rhod-4,AM染色工作液制备前，添加等体积20%Pluronic F-127溶液到Rhod-4,AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。
注②：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。
用HHBS或其他生理缓冲液将Rhod-4,AM+DMSO储存液稀释到1～10μM的工作液。
注①：Rhod-4,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
注②：Rhod-4,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1～2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1～0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。
注：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。
将准备好的Rhod-4,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育30min-1h。
注①：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod-4,AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2～3次。
注②：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
注③：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1～2次，以去除残留探针。
室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=530/555nm来进行检测。

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